文献解读：生物膜微环境触发自增强光动力免疫调节微针治疗糖尿病创面

慢性伤口是糖尿病的常见并发症，影响约25%的糖尿病患者，其愈合过程受到生物膜感染、持续炎症和血管生成受损的影响。细菌受到生物膜的细胞外聚合物（EPS）的保护，这些生物膜对抗生素和免疫细胞形成强大的屏障。由于这些生物膜被包封在EPS中，因此在伤口床上表现出特定的微环境，例如低pH和高水平的谷胱甘肽（GSH）。因此，利用生物膜微环境的特殊特性是预防生物膜感染的一种有前途的策略。

光动力疗法（PDT）作为一种抗菌方法受到了极大的关注，是一种不涉及耐药问题的微创手术。使用PDT有效治疗生物膜感染存在挑战，因为光敏剂（PS）产生的ROS可能会被生物膜中高水平的GSH耗尽。为了解决这些问题，大多数研究都集中在一氧化氮（NO）等介质对内源性GSH的消耗上。然而，利用生物膜中高 GSH 水平来增强 PDT 的策略几乎没有报道。先前的研究表明，亚硒酸盐（SeO32−）可以靶向肿瘤细胞中的高GSH水平以产生ROS，包括O2•−和 •OH。相反，对细胞致命的ROS产生在低GSH水平的正常细胞中不会被触发，从而保护细胞免于细胞凋亡。

基于这一启发，近日，来自中山大学曾小伟、陈洪中/南洋理工大学赵彦利教授团队在《Nature Communications》上发表了一篇题为“Biofilm microenvironment triggered self-enhancing photodynamic immunomodulatory microneedle for diabetic wound therapy”的文章，提出了一种通过消耗内源性GSH来有效扩大PDT的策略，并利用内源性GSH产生对生物膜更具杀伤力的活性分子，从而促进生物膜的根除。他们开发了一种微针(MN)绷带，其功能化为含有硒和二氢卟酚e6的多巴胺涂层杂化纳米颗粒(SeC@PA)，它能够双向调节活性物种(RS)的产生，包括活性氧物种( ROS)和活性氮(RNS)，响应伤口微环境。SeC@PA MN绷带可以破坏伤口覆盖物中的屏障，以实现有效的SeC@PA输送。SeC@PA不仅消耗内源性谷胱甘肽(GSH)以增强RS的抗生物膜作用，而且还通过级联反应降解生物膜中的GSH，产生更具杀伤力的RS以消灭生物膜。SEC@PA在低GSH水平的伤口床上起到RS清除剂的作用，发挥抗炎作用。SEC@PA还促进巨噬细胞的M2表型极化，加速伤口愈合。这种由创面微环境激活的自我增强、分解代谢和动态疗法为治疗慢性创面提供了一种方法。

光动力治疗示意图

在此，文章开发了一种用于糖尿病伤口治疗的多功能微针 （MN） 绷带。如图1所示。首先制备含有硒（Se）和氯e6（Ce6）的多巴胺包被杂化纳米颗粒（SeC@PA），然后在表面用L-精氨酸（LA）修饰。MN 绷带装有SeC@PA以获得SeC@PA MN。当将SeC@PA MN应用于糖尿病伤口时，理化屏障被打破，SeC@PA被有效地输送到生物膜和伤组织（图1）。我们假设，在输送到生物膜感染部位后，SeC@PA不仅可以耗尽 GSH 并生成活性氮 （RNS） 以增强 PDT 的抗生物膜作用，还可以利用生物膜中高水平的 GSH 通过一系列催化级联反应生成羟基自由基 （•OH）（图 1c）。相反，在输送到高度炎症的伤口组织后，SeC@PA通过快速清除 RS 和增强谷胱甘肽过氧化物酶 （GPX） 活性表现出强大的抗氧化作用（图 1d）。此外，SeC@PA可以有效促进巨噬细胞向M2表型极化，从而促进伤口愈合。

图1 文章摘要图

1、SeC@PA和SeC@PA MN的制备和表征

在这项研究中，首先按照既定方法制备了硒，多巴胺（DA）涂覆硒表面，包封光敏剂（Ce6）得到SeC@P，LA通过静电作用吸附在SeC@P表面形成SeC@PA。TEM图像表明，Se、SeC@P、SeC@PA颗粒均匀，表现出球状体形态，具有良好的分散性，平均直径分别为为38.42 nm、90.00nm和108.47nm。zeta电位、扫描电子显微镜（SEM）能量色散光谱仪（EDS）以及X射线光电子能谱（XPS）验证了SeC@PA的成功组装。在生物膜弱酸性的微环境下，Se 和 Ce6 在被输送到生物膜时也能被有效地释放到作用点。

进一步成功制备了SeC@PA-loaded MN，结果表明MN具有穿透屏障并直接将SeC@PA输送到所需目标区域的卓越能力。另外，SeC@PA MN在PBS中溶解速度较快，说明SeC@PA MN绷带的使用时间较短。

2、SeC@PA的抗生物膜特性

在抗生物膜评价中，金黄色葡萄球菌(SA)和假铜绿单胞菌(PA)作为代表性菌株，因为它们是从慢性伤口生物膜中分离到的最常见的菌种。首先研究了不同浓度SeC@PA(+)的抑菌活性和细胞活力。抗菌活性随着SeC@PA(+)浓度的增加而增强，同时细胞毒性也增强。为了平衡抗菌活性和细胞毒性，我们选择了含有20μg/mL Se、7.2 μg/mL Ce6和10.8 μg/mL LA的SeC@PA浓度进行后续研究。

结果表明，在所有组中，SeC@PA（+）组表现出最强的抗生物膜活性，这得益于RNS和•OH的产生。这些结果与生物膜中的RS强度结果一致。因此，本研究涉及SeC@PA产生的3种RS的抗生物膜机制，该策略被称为“RS风暴”。生物膜中的GSH可以被分解并SeC@PA（+）清除，生成RS风暴，用于生物膜的根除。

3、SeC@PA的抗氧化特性

抗生物膜产生的RS进一步加剧了伤口床的炎症反应。因此，理想的治疗效果是，在GSH水平较低的情况下，SeC@PA不仅可以清除抗生物膜产生的RS，还可以消除伤口组织产生的RS。人脐静脉内皮细胞 （HUVEC） 用于验证SeC@PA的抗氧化特性，因为 HUVEC 对 RS 极为敏感。结果表明SeC@PA可能是一个优秀的 RS 清道夫，且能显著增强谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）（是一种广泛存在于体内的重要过氧化物酶，而硒是GPX酶系统的组成部分）活性和生存能力。

4、SeC@PA促进巨噬细胞极化的特性

巨噬细胞在调节炎症和促进伤口愈合中起着核心作用，并经历极化为 M1 和 M2 表型33–35.慢性伤口被 M1 表型巨噬细胞浸润，导致持续的炎症反应，延迟伤口愈合36,37.已经证明，M2表型巨噬细胞在调节炎症、促进血管生成和伤口愈合方面起着关键作用38,39.因此，增强巨噬细胞对 M2 表型的极化为加速慢性伤口愈合提供了机会。结果表明，SeC@PA（+）可以有效地激活巨噬细胞对M2表型的极化，且通过JAK-STAT6途径发生的。

5、通过SeC@PA促进细胞迁移和血管生成

评估了在 SeC@PA（+） 上培养的 HUVEC 中的迁移和管形成。SeC@PA（+）由于RS的清除作用，细胞迁移和血管生成得以恢复。然而，与对照组相比，SeC@PA（+）治疗并未导致HUVEC的迁移和血管生成显着增加。考虑到巨噬细胞极化为M2型促进伤口愈合，我们进一步探讨了添加RAW264.7细胞对HUVECs行为的影响。结果显示SeC@PA（+）可以通过调节巨噬细胞极化到 M2 型来促进伤口愈合，从而分泌 VEGF，从而促进 HUVEC 中的迁移和管形成。

6、SeC@PA能显著促进糖尿病小鼠生物膜感染创面

研究显示单独PDT治疗产生的RS（C@PA MN（+））具有延迟糖尿病慢性伤口愈合的风险。必须立即去除PDT产生的RS，以避免对伤口组织造成二次伤害。SeC@PA MN （+） 可有效清除创面组织中 PDT 产生的 RS，缓解氧化应激，促进创面愈合。并且SeC@PA MN有效地刺穿了伤口覆盖物，并将SeR@PA输送到伤口覆盖物的底部，并且SeR@PA的穿透深度随着给药时间的延长而增加，实现更深、更广的药物递送，有效根除生物膜，减少氧化应激，促进伤口内血管生成和胶原沉积，促进伤口愈合。

结论

生物膜感染、持续炎症和血管生成受损是糖尿病慢性伤口的标志。PDT 因其产生 ROS 的优点而被广泛研究为抗菌疗法。然而，生物膜中的高 GSH 浓度限制了 PDT 的治疗效果。此外，ROS在根除生物膜和加剧炎症方面起着双重作用。PDT在短时间内产生大量的ROS。虽然这些ROS是短暂的，但它们会延迟伤口愈合，特别是在具有严重氧化应激的慢性伤口中，这种损伤更严重。要解决这个问题，就需要引入额外的ROS清除剂，这不仅使系统复杂化，而且阻碍了其临床转化。此外，慢性伤口通常被炎症性渗出物覆盖，这些渗出物与生物膜一起形成屏障。局部使用的药物必须通过屏障到达下面的活细胞，同时对抗反向发生的渗出物转运，因此，局部药物的生物利用度大大降低。因此，本研究设计了一种高效的SeC@ PA MN来治疗慢性糖尿病伤口，代表了通过靶向生物膜和伤口床的不同微环境来初步探索慢性伤口的潜在治疗方法。这些发现为有效管理慢性伤口的局部治疗的合理设计提供了宝贵的见解。