文献解读：单核细胞来源的IL-6使小胶质细胞重建受损的脑血管系统

美国国家卫生研究院、国家神经疾病和中风研究所的病毒免疫学和活体成像科的贝塞斯达教授团队在Nature Immunology（IF=30.5）上发表了题目为《单核细胞来源的白介素6使小胶质细胞重建受损的脑血管系统》的研究报告。

脑血管损伤（CVI）是一种常见的病理学损伤，由感染、损伤、中风、神经退行性疾病和自身免疫性疾病等引起。快速解决CVI需要协调先天免疫反应。在这个研究中，研究人员探索中枢神经系统浸润的单核细胞如何编程驻留的小胶质细胞来介导脑血管损伤后的血管生成和脑血管修复。在人类中风脑损伤的缺血半暗带中，鉴定出一种表达血管内皮生长因子A（VEGFA）的小胶质细胞亚群，这些细胞被称为“修复相关小胶质细胞”（RAMs），也在CVI的小鼠模型中被观察到，并共表达白细胞介素（IL）-6Ra。在IL-6敲除小鼠或缺乏小胶质细胞IL-6Ra表达的小鼠中，脑血管修复并未发生，单细胞转录组分析揭示了IL-6信号缺失时RAM编程的缺陷。在CVI后，CCR2+单核细胞是IL-6的主要来源，并需要赋予小胶质细胞增殖和促血管生成的特性。在缺乏IL-6或炎症单核细胞的情况下，RAM编程出现缺陷，导致脑血管修复不良、神经元破坏和持续的神经功能缺陷，这些缺陷都可以通过外源性IL-6给药来恢复。这些数据提供了一种分子和细胞基础，说明单核细胞如何指导小胶质细胞修复受损的脑血管，并在损伤后促进功能恢复。

该研究从以下7部分内容进行了实验

图1 证明CVI诱导RAM生成。a，小鼠大脑中CVI诱导（红色）的示意图，从冠状（左上角）和轴向（右上角）视图显示。时间线显示了TAM饲喂和撤除与CVI和RAM分析的关系。b，来自Tmem119-TdTo小鼠（n = 4）的时间序列图像，通过TPM通过薄颅窗成像，显示CVI的急性小胶质细胞反应。荧光番茄凝集素（红色，伪彩色）通过静脉注射以可视化血管和从血液中渗出的物质。几分钟后，小胶质细胞迅速向受损血管（白色箭头）伸出突起，并与渗出的、凝集素衍生的物质相互作用（青色箭头）。c，在CVI后第6天，Tmem119-TdTo小鼠新皮层的VEGFA（白色）免疫荧光染色。左面板中用绿色虚线框表示的放大图像显示在右面板中。小胶质细胞（红色）在细胞体和远端突起（青色箭头）中表达VEGFA。d，e，条形图显示CVI后第6天损伤侧（Ipsi）与未损伤侧（Contra）半球的小胶质细胞（d）和VEGFA表达小胶质细胞（e）数量。c-e中的数据来自两个独立的实验。f，B6小鼠在CVI后第6天相对于未损伤对照组（Ctrl）的新皮层中IL-6Ra（红色）、VEGFA（白色）和Iba1（绿色）的免疫荧光染色。CVI诱导小胶质细胞中IL-6Ra的表达，其中一些同时表达VEGFA（黄色框1和2）。框区放大显示在右侧。g，h，条形图描绘了未损伤对照组（Ctrl，n = 8）与CVI（n = 7）小鼠中IL-6Ra+（g）和IL-6Ra+VEGFA+（h）小胶质细胞的定量。f-h中的数据来自两个独立的实验。i，UMAP图显示损伤（n = 4）与未损伤（Ctrl，n = 4）Tmem119-TdTo小鼠在CVI后第6天从活检脑组织中提取的免疫细胞的高参数流式细胞术数据。虚线划定了RAMs。j-l，条形图显示损伤组与未损伤组中RAMs（TdTo+VEGFA+IL-6Ra+CD24+CD44+CD206+CD11c+Ly6clo/intMHCIIloCX3CR1+CD11b+CD45lo/int）（j）、非RAMs（TdTo+VEGFA−IL-6Ra−CD24−CD44−CD206−CD11c−Ly6c−MHCIIloCX3CR1+CD11b+CD45lo）（k）和MDMs（TdTo−CD24+CD44+CD206+CD11c+Ly6c+CX3CR1+CD11b+CD45+）（l）的数量。所有图表显示平均值±标准差，点代表个体小鼠。***P < 0.0005，****P < 0.0001；双尾，独立样本t检验。NS，不显著。

图2 表明了RAMs在脑损伤严重程度增加时增加，并在人类中风大脑中被观察到。a，通过活检穿刺法从第6天轻度（n=4）与重度（n=4）CVI Tmem119-TdTo小鼠的脑组织中分离出的白细胞高参数流式细胞术数据代表性UMAP图。虚线表示RAMs。b-d，柱状图显示RAMs（TdTo+ VEGFA+ IL-6Ra+ CD24+ CD44+ CD206+ CD11c+ Ly6clo/intMHCIIloCX3CR1+ CD11b+ CD45lo/int）（b）、MHCIIhi RAMs（TdTo+ VEGFA+ IL-6Ra+ CD24+ CD44+ CD206+ CD11c+ Ly6c+ MHCIIhiCX3 CR1+ CD11b+ CD45+）（c）和MDMs（TdTo- CD24+ CD44+ CD206+ CD11c+ Ly6c+ CX3CR1+ CD11b+ CD45+）（d）的绝对数量，如a中所示的组。数据代表两个独立的实验。***P<0.0005，****P<0.0001；双尾，独立样本t检验。e，通过活体TPM捕获的表面新皮层血管的最大投影图像，显示未受伤（n=8）与第10天轻度（n=9）和重度（n=6）CVI小鼠的成像。注射碘酸酯（绿色）和EB（红色）之前进行静脉注射。f，g，柱状图显示小鼠百分比血管覆盖（f）和额外渗漏的番茄凝集素（g）的量化，如e中所示。数据来自两个独立的实验。***P<0.0005，****P<0.0001；单因素方差分析，Tukey检验。在b-g中，点表示单个动物。h，代表人类中风（n=4）脑组织（患者ID AN-060-37）与对照组（n=4）脑组织（患者ID 85747）的多重免疫染色，无神经系统疾病（补充表1）。组织用抗VEGFA（白色）、IBA1（绿色）、红细胞、CD31（黄色）和纤维蛋白原（青色）抗体染色。细胞核呈蓝色。黄色虚线表示梗死核心与周围半影之间的边界。黄色虚线框表示放大图像的位置。橙色箭头指向在周围中风组织中表达VEGFA的具有分支小胶质细胞形态的IBA1+细胞。粉红色箭头表示在梗死核心中表达低量VEGFA的球形IBA1+细胞。i，柱状图显示对照组、周围和中风ROI中VEGFA+ IBA1+髓样细胞的百分比量化，来自对照组（n=4）和脑卒中（n=4）脑组织。单个点表示从每个标本分析的一个到三个ROI的平均百分比VEGFA+ IBA1+髓样细胞（参见扩展数据图2f）。*P<0.05，**P<0.005；单因素方差分析，Tukey检验。所有图形显示平均值±标准误。

图3表明了浸润的巨噬细胞产生IL-6，对RAM生成至关重要。a，在CVI后第6天，Tmem119-TdTo小鼠新皮层的Iba1（绿色）和TdTo（红色）免疫荧光染色。数据代表两个独立的实验。b，饼状图展示了未受伤（n=8）与受伤（n=7）小鼠大脑中TdTo-Iba1+（巨噬细胞/小胶质细胞，红色）和TdTo+Iba1+（小胶质细胞，灰色）的比例。数据代表两个独立的实验。****P<0.0001；双尾，非配对学生t检验。c，时间推移的活体TPM图像显示CVI后第2天（n=3只小鼠）单核细胞向实质内渗出。白星表示一个Ly6c+单核细胞（红色）从血管（用白虚线标出）渗入实质（补充视频2）。d，在CVI后第1天、第3天和第6天（D1、D3、D6），CX3CR1gfp/+CCR2rfp/+（n=7只小鼠/组）小鼠大脑中Iba1（绿色）和RFP（红色）的免疫荧光染色。在抗Iba1和RFP染色前，绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）被光漂白。e，柱状图展示了在指定时间点后CVI后CCR2-RFP+单核细胞/mm2大脑组织的绝对数量。d和e中的数据来自两个独立的实验。**P<0.005，***P<0.0005，****P<0.0001；单因素方差分析（ANOVA），Tukey检验。f，通过活检穿刺从WT（n=6）和Ccr2-/-（n=6）小鼠分离的免疫细胞的高参数流式细胞术数据。虚线划定了RAM和MDM。g，h，柱状图展示了WT与Ccr2-/-小鼠中RAM（g）和MDM（h）的绝对数量，数据来自f。UMAPs左上角的细胞簇对应于CD45-非免疫细胞。数据来自两个独立的实验。**P<0.005，***P<0.0005；双尾，非配对学生t检验。i，代表RNAscope原位杂交图像，显示Il-6转录本（白色）与Iba1、RFP、GFAP和CD31的免疫荧光染色相结合，在CVI后第3天WT与Ccr2-/-小鼠同侧（受伤）与对侧（未受伤）新皮层。在抗Iba1和RFP染色前，GFP和RFP被光漂白。以下细胞类型被鉴定：巨噬细胞/小胶质细胞（Iba1+CCR2-RFP-）、单核细胞（CCR2-RFP+）、星形胶质细胞（GFAP+）和内皮细胞（CD31+）。细胞核显示为蓝色。j，k，柱状图展示了每种细胞类型表达Il-6的百分比（j）和每种细胞类型中表达Il-6的细胞的百分比（k），数据来自i中描述的小鼠。i-k的数据来自两个独立的实验。j中标有星号的数据点表示单核细胞与其他IL-6表达细胞之间存在显著差异：****P<0.0001；单因素方差分析（ANOVA），Tukey检验。本图所有图形均显示平均值±标准差。点代表个体动物。

图4 | ScRNA-seq揭示IL-6缺乏症损害了所有组别的促血管生成性分区。g、h、热图显示了聚集的微胶质编程。a、示意图说明了通过punch活检从每个实验组别中分离出CD11b+细胞，并通过scRNA-seq对纯化的单细胞悬液表达10个促血管生成基因（图f）的每个分区（g）进行评估。i、UMAP描述了在WT和Il6−/−小鼠第6天CVI后新皮层分区P1的钻取分析。b、UMAP描述了7个分区，基于9,027个细胞通过scRNA-seq处理。每个点代表一个细胞，每种颜色表示一个分区，用不同的颜色标记。列出了每个集群的顶级加权信号通路。这些通路是通过GSEA分析DEGs（q < 0.05）在受伤和未受伤小鼠之间确定的。j、柱状图显示了每个集群中细胞类型的比例，这些细胞类型被归因于四个标记为P1的组别。点的大小表示每个组别中细胞的百分比。k、UMAPs描述了WT和Il6−/− CVI小鼠P1分区中表达所表示基因的细胞，颜色反映了平均表达水平。d、WT和Il6−/− CVI小鼠在微胶质P1 C2中的基于Pearson相关系数的聚类热图。点的大小对应于WT和Il6−/− CVI小鼠之间的平均表达水平。e、UMAP显示了WT和Il6−/− CVI小鼠所有分区的比较。在图上，路径按-log(P值)乘以相应的z-score排序。只有具有统计学意义（P < 0.05）的路径才显示在图上。

图5 | 单核细胞和IL-6对RAM生成、血管修复和功能恢复至关重要。a，实验时间表示意图。b，c，柱状图显示WT（n=4）、Ccr2−/−（n=5）和Il6−/−（n=4）小鼠在CVI后第6天皮质穿孔活检中RAMS（b）和MDMs（c）的绝对数量。数据代表两个独立的实验。*P<0.05，**P<0.005；单因素方差分析，Tukey's test。d，e，柱状图显示未受伤Ccr2−/−小鼠（n=2）以及CVI后第6天未接受移植或接受WT（n=4）与Il6−/−（n=4）单核细胞移植的Ccr2−/−小鼠的RAMS（d）和MDMs（e）的绝对数量。数据代表两个独立的实验。*P<0.05，**P<0.005；单因素方差分析，Tukey's test。f，通过变薄的颅骨捕获WT（n=7）、Ccr2−/−（n=6）和Il6−/−（n=6）小鼠在CVI后第10天的活体TPM图像。番茄凝集素（绿色）和EB（红色）静脉注射以可视化血管。g，h，柱状图显示f中各组小鼠血管覆盖（g）和间血管区域（h）的定量。数据来自两个独立的实验。****P<0.0001；单因素方差分析，Tukey's test。i，WT（n=8）、Ccr2−/−（n=6）和Il6−/−（n=7）小鼠在CVI后第10天新皮层免疫荧光染色，显示Iba1（绿色）、GFAP（红色）和NeuN（白色）。黄色虚线表示脑表面。j，柱状图显示i中各组小鼠每平方毫米组织中NeuN+神经元的数量。数据来自两个独立的实验。**P<0.005，***P<0.0005；单因素方差分析，Tukey's test。k，Y迷宫行为测试示意图，用于评估小鼠认知-运动功能。l，m，柱状图显示WT（n=8）、Ccr2−/−（n=8）和Il6−/−（n=7）在CVI后第21天和第42天的Y迷宫臂条目（l）和三重比（m）。l和m中的数据来自两个独立的实验。**P<0.005，***P<0.0005，****P<0.0001；双因素方差分析，Holm-Šidák test。所有图形显示平均值±标准误。点代表个体动物。

图6 | 小胶质细胞IL-6信号传导有助于RAM生成和血管修复。a，示意图显示了条件性地从小胶质细胞中删除IL-6Ra的实验时间线和策略（ΔmIL-6Ra小鼠）。b，直方图显示了从CVI后第6天脑部CD45+CD11b+细胞中膜结合IL-6Ra的表达，相对于FMO对照组（灰色）。直方图中的值表示每种条件下的中位荧光强度。数据代表两个独立的实验。c，d，条形图显示了通过流式细胞分析从皮质活检中分离的免疫细胞中RAMs（TdTo+VEGFA+IL-6Ra+CD24+CD44+CD206+CD11c+Ly6clo/intMHCIIloCX3CR1+CD11b+CD45lo/int）（c）和MDMs（TdTo−CD24+CD44+CD206+CD11c+Ly6c+CX3CR1+CD11b+CD45+）（d）的百分比，ΔmIL-6Ra小鼠（n = 4）相对于其同窝对照组Ctrl（n = 8）在CVI后第6天。数据来自三个独立的实验。**P < 0.005；双尾，非配对学生t检验。e，表示通过薄颅骨TPM图像显示Ctrl IL-6Ra（n = 8）与ΔmIL-6Ra（n = 6）小鼠在CVI后第10天的血管。通过静脉注射凝集素（绿色）和EB（红色）来可视化血管。f，g，条形图显示了在e中表示的组别中的血管覆盖（f）和间血管区域（g）的定量。数据来自两个独立的实验。***P < 0.0005；双尾，非配对学生t检验。h，表示在CVI后第10天Ctrl IL-6Ra（n = 6）与ΔmIL-6Ra（n = 7）小鼠新皮层的共聚焦图像。通过静脉注射凝集素（绿色）和EB（红色）来可视化血管并测量BBB完整性。i，条形图显示了在h中表示的组别中每平方毫米组织中EB的量。数据来自两个独立的实验。***P < 0.0005；双尾，非配对学生t检验。j，表示在CVI后第10天Ctrl IL-6Ra（n = 6）与ΔmIL-6Ra（n = 7）小鼠新皮层的共聚焦图像，染色为Iba1（绿色），GFAP（红色）和NeuN（白色）。k，条形图显示了在j中表示的组别中每平方毫米组织中NeuN+神经元的数量。数据来自两个独立的实验。***P < 0.0005；双尾，非配对学生t检验。l，m，条形图显示了Ctrl IL-6Ra（n = 9）和ΔmIL-6Ra（n = 8）小鼠在CVI后第21天的Y-迷宫臂条目总数（l）和三重比率（m）。显示了两个独立实验的数据。**P < 0.005；双尾，非配对学生t检验。所有图形均显示平均值±标准误差。点代表个体动物。

图7 | 外源性IL-6恢复Ccr2−/−小鼠的RAM、血管修复和功能恢复。a，实验时间线和颅骨外IL-6应用示意图。b，c，柱状图显示通过流式细胞分析从皮质活检中分离的白细胞中确定的RAM（b）和MDM（c）的绝对数量。WT + vehicle（n = 5），Ccr2−/− + vehicle（n = 4）和

Ccr2−/− + rIL-6（n = 5）在CVI后第6天。数据代表两个独立的实验。*P < 0.05，**P < 0.005，***P < 0.0005；单因素方差分析，Tukey多重比较检验。d，通过薄颅骨捕获的TPM代表性活体图像，WT + vehicle（n = 6），Ccr2−/− + vehicle（n = 6）和Ccr2−/− + rIL-6（n = 7）在CVI后第10天。番茄凝集素（绿色）和EB（红色）通过静脉注射以可视化血管。e，f，柱状图显示d中指定组小鼠的血管覆盖（e）和间血管面积（f）的量化。数据来自两个独立的实验。*P < 0.05，****P < 0.0001；单因素方差分析，Tukey多重比较检验。g，WT + vehicle（n = 5），Ccr2−/− + vehicle（n = 6）和Ccr2−/− + rIL-6（n = 6）小鼠在CVI后第10天新皮层的免疫荧光染色，显示Iba1（绿色），GFAP（红色）和NeuN（白色）。h，柱状图显示g中指定组小鼠每平方毫米组织中NeuN+神经元的数量。数据来自两个独立的实验。**P < 0.005，****P < 0.0001；单因素方差分析，Tukey检验。i，j，柱状图显示WT + vehicle（n = 8），Ccr2−/− + vehicle（n = 8）和Ccr2−/− + rIL-6（n = 8）在CVI后第21天和第42天的Y迷宫臂条目总数（i）和三重比（j）。数据来自两个独立的实验。*P < 0.05，**P < 0.005，***P < 0.0005，****P < 0.0001；双因素方差分析，Tukey多重比较检验。所有图形显示平均值±标准误差。点代表个体动物。

该研究中，发现了单核细胞-小胶质细胞对话对脑血管修复和功能脑恢复至关重要。数据表明，促血管生成性RAMS是响应人类和小鼠脑血管损伤而建立的内在脑修复程序的重要组成部分。使用小鼠CVI模型，证实单核细胞是主要招募到受损脑组织的外周免疫细胞，也是IL-6生成所需的主要来源，IL-6是RAMS生成的必要条件。还在单细胞水平上研究了髓系细胞的转录组景观，证明CVI在小胶质细胞和MDMs中诱导了多个信号通路，包括IL-6、TNF-α和IFN-I信号通路。值得注意的是，研究发现了一种表达促血管生成基因特征的高度增殖性小胶质细胞亚群（RAMS）。在缺乏IL-6信号或CCR2+单核细胞的情况下，RAMS生成受到阻碍，导致脑血管修复失败、BBB泄漏、神经细胞死亡、纤维化和功能恢复减弱。重要的是，外源性IL-6治疗能够通过恢复RAMS生成和脑血管重塑来弥补CCR2+单核细胞缺陷。因此，该研究提出IL-6诱导的VEGFA+RAMS是成功血管修复和功能脑恢复所必需的。

总之，该研究结果为了解CVI恢复过程提供了重要的机制见解，通过展示单核细胞如何通过IL-6信号传导促进RAMs的生成。人类在CVI后的恢复轨迹可能受到许多不同因素的影响；未来研究中的重要任务是确定是否可以通过向巨噬细胞提供竞争性IL-6信号传导来增强修复。增强CVI恢复轨迹的治疗方法有可能改善许多不同人类CNS疾病的预后。

原文：Choi BR, Johnson KR, Maric D, McGavern DB. Monocyte-derived IL-6 programs microglia to rebuild damaged brain vasculature. Nat Immunol. 2023 Jul;24(7):1110-1123.